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Conociendo más sobre Factor VIII de Coagulación
1. Tratamiento de la Hemofilia
La hemofilia sin tratamiento es una enfermedad mortal. A comienzos de siglo, la expectativa de vida era menos de quince años. Hoy en día es de diez años menos que la de los varones sin hemofilia.
La hemofilia es tratable, aún en su forma más severa. Sin tratamiento, conduce a una discapacidad crónica precoz, y muy a menudo muerte prematura. Si bien el tratamiento adecuado es costoso, el tratamiento inadecuado es aún más costoso, tanto para los individuos como para sus familias y la comunidad en general. La falta de tratamiento apropiado y oportuno puede llevar a las siguientes situaciones:
Daños en las articulaciones y la necesidad de tratamiento ortopédico.
Daños múltiples en las articulaciones y pérdida de la estructura muscular normal, conduciendo a una movilidad gravemente limitada
Uso permanente de muletas o sillas de ruedas.
Hospitalización prolongada.
El mal uso o incluso el derroche de costosos productos terapéuticos.
Ausentismo escolar, el cual limita a su vez las oportunidades educacionales y de empleo para los individuos con hemofilia.
Trastornos de la vida familiar debido a la búsqueda de tratamiento para los niños con hemofilia.
El tratamiento se basa en la inyección del factor deficiente directamente en la vena del paciente. El tratamiento puede prevenir hemorragias o minimizar sus efectos de manera que el paciente permanezca libre de incapacidades y complicaciones.
Las hemorragias cesan cuando una cantidad suficiente de factor de coagulación llega al sitio lesionado. El reemplazo del factor carente puede ser hecho en anticipación de una hemorragia o, como es la práctica común, tan pronto como el paciente se de cuenta que está sangrando. Cuando el tratamiento se administra al comienzo de un episodio de sangrado, las probabilidades que continúe la hemorragia se reducen. Cuando se aplaza el tratamiento, la hemorragia continúa y progresa, causando más daños en los tejidos, aumentando a su vez, la probabilidad de hemorragias adicionales posteriormente. La terapia precoz por lo tanto, consigue un aumento en la capacidad del paciente y una reducción en la necesidad de tratamientos repetidos.
Cada paciente hemofílico requerirá diferente cantidad de unidades de Factor VIII según el nivel de Factor VII en sangre (leve, moderada, severa) y de la severidad de la hemorragia en un momento dado o del riesgo de sangrado secundario a una intervención traumatológica o cirugía. Lo que se busca es mantener el nivel de Factor VIII:C por encima de 30% para que no sangre activamente. Hay casos donde se requerirá que el nivel sea del 100%. En líneas generales, la cantidad habitual de Factor VIII requerida anualmente para administrar tratamiento a un adulto con hemofilia A severa en UI, podemos verlo en el cuadro siguiente.
| Tipo de tratamiento | UI requeridas |
| Profilaxis* | Hasta 218.000 |
| Terapia a demanda en países industrializados | De 60.000 a 100.000 |
| Nivel moderado de tratamiento | 40.000 |
| Nivel mínimo de tratamiento | De 15.000 a 20.000 |
*Calculada de la siguiente forma para una persona de 70 Kg: 20 UI x kg x 3 veces x 52 semanas = 218.400 UI/año
En todo caso, hay que hacer profilaxis con la terapia de Factor VIII y no esperar a que ocurra el evento del sangrado para detenerlo. Por ello es que se calcula como dosis mínima 3 veces por semana 20 UI/kg de peso.
Unidades requeridas de Factor VIII para una población de 20.000.000 de habitantes, dado que la mitad de la población es masculina.
| Cantidad de casos | 10 millones 1/10.000 = 1.000 personas con Hemofilia A |
| Nivel moderado de tratamiento | 1.000 x 40.000/año = 40.000.000 UI FVIII |
2. Dosis de Factor VIII
La dosis requerida de Factor VIII Humano depende del status hemofílico de cada paciente en particular y del propósito del tratamiento. Generalmente se establece que, en un paciente sin hemorragia activa, una infusión de 1 Unidad Internacional (UI) por kilogramo de peso corporal produce un incremento promedio de alrededor de 2 Unidades Internacionales por cada 100 ml de plasma. Esto puede ser expresado mediante la siguiente ecuación:
3. Estructura Molecular del Factor VIII
El gen (fragmento de ADN) que codifica la síntesis de la proteína del Factor VIII se encuentra ubicado en el cromosoma X (Fig. 11).
El Factor VIII es una glicoproteína que se sintetiza en las células hepáticas (hepatocitos) y en las células endoteliales, inicialmente como una proteína precursora de cadena sencilla de 2.351 aminoácidos con un peso molecular de 265.000 daltons. La molécula precursora intacta comprende tres tipos de dominios, tal como se muestra en la figura 13:
Dominio A: tres segmentos A (A1, A2, A3), cada uno de 330 aminoácidos aproximadamente.
Dominio B: un segmento central único que consta de 980 aminoácidos
Dominios C: dos segmentos C (C1, C2) de 150 aminoácidos cada uno.
En el plasma, la molécula de Factor VIII es escindida para producir dos péptidos, una cadena amino terminal pesada (dominios A1, A2, B) y una cadena carboxi terminal liviana (A3, C1, C2). La proteína circula como un dímero, con iones de calcio ligando entre sí las dos cadenas mediante el enlace de los dominios A y C.
Cuando se la activa con trombina, la cadena pesada se escinde, liberando el dominio B, que no se requiere para la actividad de la coagulación. La trombina generada durante el proceso de coagulación potencia la actividad coagulante.
Varias escisiones adicionales generan péptidos de 50, 43 y 73 kilodaltones (kd), produciéndose una actividad de coagulación máxima. Si se efectúan más escisiones se inactiva la actividad coagulante de la proteína del Factor VIII. La proteólisis es en sí misma un acontecimiento inactivante. El Factor VIII se inactiva al actuar la Proteína C Activa (PCA) en la Arginina 336 formando una banda de 59 kd y otra de 43 kd. El Factor X lo inactiva mediante la proteólisis en Arginina 336 y 1.721 generando una banda de 67 kd. La trombina lo inactiva al activar la PC que es su inhibidor fisiológico.
Por sí solo, el Factor VIII es una molécula inestable altamente reactiva. Se estabiliza en el plasma mediante el enlace con el Factor von Willebrand.
4. Inhibidores del Factor VIII
Los inhibidores son anticuerpos frente al Factor VIII o Factor IX que impiden la efectividad de la terapia. Aparecen casi exclusivamente en pacientes con hemofilia moderada o grave. Se desarrollan en una minoría de los pacientes y es posible predecir la disposición natural de un individuo dado para desarrollarlos si se conoce el patrón de mutación de su gen. La mayoría de los inhibidores surgen después de relativamente pocos tratamientos (los primeros 100 días de estar recibiendo concentrados de Factor VIII), generalmente a temprana edad. En general, cuanto mayor sea el tratamiento recibido por un hemofílico, sin haber desarrollado un inhibidor, menor será la posibilidad que desarrolle uno. La aparición de un inhibidor puede complicar el tratamiento y hacerlo más costoso.
5. Breve Historia de la Terapia de Hemofilia A
Década de 1.950
Los años posteriores a la Segunda Guerra Mundial fueron testigo de un crecimiento explosivo de la ciencia de la sangre y de la investigación sobre la hemofilia. Con el paso de cada década los investigadores han ganado una comprensión más profunda de este trastorno y los fabricantes han desarrollado preparados de Factor VIII cada más puro.
El plasma separado de sangre donada normal y entera contiene el Factor VIII que necesita el paciente con hemofilia. Sin embargo, como se presentan niveles de Factor VIII tan bajos. El plasma fresco congelado no podía ser infundido sin causar eficazmente sin causar una sobrecarga de volumen.
Década de 1.960
Esta dificultad se redujo mediante el desarrollo de un proceso de congelación/descongelación para recuperar el Factor VIII que se concentra en el crioprecipitado al ser descongelado el plasma. En 1.966 se produjo el primer concentrado de Factor VIII comercial, una forma de crioprecipitado secado por congelación, derivado de una gran mezcla de plasma donado.
Década de 1.970
Se produjeron concentrados de Factor secado por congelación en cantidad, concentración y pureza nunca antes logrados. Las pruebas para detectar antígenos de la Hepatitis B en el plasma se iniciaron en 1.972.
Década de 1.980
A mediados de esta década, la inactivación viral de gran cantidad de mezclas donadas, se transformó en el foco de la industria de productos de la sangre a través del método Solvente/Detergente desarrollado por el New York Blood Center. En 1.985 es cuando se introduce en los Bancos de Sangre la prueba para detectar anticuerpos para el VIH. La tecnología floreciente de fines de la década de 1.980 y de 1.990, junto con procedimientos perfeccionados de recolección, produjeron un aumento de la pureza por medio de:
Técnicas de purificación del anticuerpo monoclonal: que separa el factor del contenido restante del plasma.
Mayor rigor en la evaluación de donantes y el análisis de la mezcla de plasma donado para eliminar virtualmente la transmisión de VIH, VHC y VHB a través de productos derivados del plasma. En 1.992 fue cuando se introdujo la prueba para la detección de anticuerpos contra el VHC en donantes.
Desgraciadamente, antes de estos logros, alrededor de la mitad de la población hemofílica, contrajo VIH y muchos murieron de SIDA.
Década de 1.990
Tecnología recombinante de ADN: mediante la cual los fabricantes pueden usar líneas celulares animales para producir grandes cantidades de Factor VIII recombinante de alta pureza.
El análisis para antígeno p-24 fue recomendado en 1.996.
Los análisis negativos no garantizan la ausencia de infectividad, pues los donantes podrían tener niveles bajos de anticuerpos o haber tenido una infección reciente sin haber desarrollado todavía anticuerpos (ventana de infectividad).
Como medida adicional de seguridad, se comenzó con el análisis de PCR para detectar VIH, VHB y VHC en mezclas de plasma de donantes y más tarde en los pasos de purificación intermedia o en el recipiente final.
Desde entonces, se ha introducido la combinación de varias medidas para reducir la contaminación viral de los productos de la sangre, y su diseminación a los receptores, como son:
Exclusión de donantes de alto riesgo con un posible historial de contacto con enfermedades contagiosas.
Análisis de donaciones individuales de sangre o plasma contra patógenos conocidos. Pruebas obligatorias: VIH, Hepatitis B y Hepatitis C.
Actividades de vigilancia para identificar infecciones en donantes o receptores y períodos de cuarentena entre la recolección y la distribución que permiten una verificación adicional de la salud del donante.
Técnica de amplificación de ácidos nucleicos (NAT) de VHC (ARN) y cada vez más para otros virus como: VIH, VHB, Parvovirus B19 y VHA, en lotes mínimos y exclusión de donaciones reactivas
Retirada de todo el material elaborado de lotes de fuentes que contienen donaciones de individuos que posteriormente se ha demostrado que estaban infectados con una enfermedad contagiosa.
Una vez que el plasma llega a los fraccionadores, se vuelve a analizar usando métodos pertinentes.
Aplicación de nuevos procedimientos tecnológicos para la desactivación viral. Inclusión de varios métodos específicos validados para la inactivación y/o eliminación de virus durante el proceso de fabricación.
Atención a la incidencia de infección en la población de la cual se eligen los donantes. Por ejemplo, la sangre proveniente de áreas donde existe una baja prevalencia del VIH o de la Hepatitis C resultará en un producto más seguro que la sangre proveniente de áreas donde la prevalencia de dichos factores es más alta.
6. Elaboración de Factor VIII
Los criterios para la preparación del Factor VIII incluyen:
Donaciones seguras provenientes de donantes sanos.
Análisis individual de cada donación contra patógenos conocidos, especialmente VHB, VHC y VIH 1 y 2.
Procesamiento rápido y diestro que conserve las cantidades activas presentes del factor de coagulación y mejorar el rendimiento final.
Uso de una tecnología de reducción viral para garantizar que los productos son seguros y no transmitirán enfermedades virales.
Los factores de coagulación se encuentran en las siguientes preparaciones de tratamiento ordenadas según su concentración de menor a mayor:
Sangre completa
Plasma
Crioprecipitado
Concentrado de factor VIII
La cantidad de cualquiera de los factores de coagulación en la sangre completa o en el plasma es insuficiente en proporción al volumen necesario para una terapia adecuada en la gran mayoría de los episodios de sangrado.
En muchos casos de hemofilia A leve y en la mayoría de los casos de la enfermedad de von Willebrand, el propio organismo es capaz de liberar suficiente Factor VIII si es estimulado por la hormona sintética llamada Desmopresina (DDAVP). Esta hormona puede ser administrada intravenosamente, por inyección subcutánea o en una preparación altamente concentrada, con un atomizador intranasal.
Las hemorragias graves o las cirugías requieren terapia de reemplazo continua o intermitente para mantener niveles adecuados de los factores de la coagulación.
La atención integral involucra una variedad de tratamientos y control cuidadoso: episodios hemorrágicos, tratamiento sustitutivo, detección de inhibidores, evaluaciones músculo-esqueléticas e inmunológicas, evaluaciones para fisioterapia y ejercicios, apoyo psicológico, asistencia odontológica, etc. Los miembros del equipo de atención integral trabajan para prevenir problemas o para tratarlos en sus etapas iniciales antes de que afecten la salud o bienestar del individuo.
7. Materia Prima para la Elaboración del Factor VIII
a) Plasma
El plasma humano es la parte líquida de la líquida de la sangre humana que queda después de separar los glóbulos rojos, blancos y plaquetas. Se obtiene al centrifugar la sangre completa y luego puede ser utilizado en los pacientes como plasma fresco congelado (PFC) o puede ser fraccionado a nivel industrial para obtener una variedad de productos plasmáticos. Si el plasma no se almacena congelado a -20°C o menos, los factores de coagulación tales como Factor VIII se deterioran rápidamente y el rendimiento se reducirá considerablemente.
Una bolsa con PFC contiene de 200 a 250 ml que a su vez contienen de 70 a 90 unidades/dl de Factor VIII, Factor IX y Factor vW y otros factores plasmáticos de la coagulación. El uso de plasma completo está limitado por la cantidad de expansión del volumen intravascular que puede tolerar el paciente. Las reacciones alérgicas son comunes en pacientes que han recibido plasma frecuentemente. El plasma se usa para tratar deficiencias de factores de coagulación para los cuales no hay concentrados disponibles.
b) Crioprecipitado
Se prepara al congelar rápidamente el plasma recién extraído en un congelador a -60°C o en un baño de hielo seco y etanol. Después se descongela lentamente entre 2° y 4°C y el precipitado se recolecta por centrifugación. El crioprecipitado es rico en Factor VIII, factor von Willebrand y fibrinógeno y puede ser usado para terapia sustitutiva en pacientes con hemofilia A o con enfermedad de von Willebrand. No contiene factor IX y por lo tanto no puede ser usado para la Hemofilia B. El crioprecipitado tiene un volumen de 30 ml aproximadamente y debe ser almacenado en un congelador a temperaturas inferiores a los -20°C. Tiene una vida útil de hasta un año cuando se almacena a -30°C o menos.
La concentración del Factor VIII en el crioprecipitado es de 80 U de FVIII y FvW y de 200 a 300 mg de fibrinógeno, diez a quince veces menor que en la de los concentrados de Factor VIII comerciales. Debe ser transportado y almacenado congelado. Se pueden presentar reacciones alérgicas en personas sensibles. Generalmente no es tratado con ningún método de inactivación viral. Se usa algunas veces para tratar pacientes con enfermedad de von Willebrand cuando no es adecuado usar el DDAVP o para tratar la hemofilia A leve o las deficiencias de fibrinógeno.
Pasos claves en la producción de crioprecipitado y concentrados de factor
8. Concentrados de Factor VIII Humano
Los concentrados de Factor VIII derivados de plasma, en procedimientos comerciales, se elaboran de plasma proveniente de miles de donantes. El Factor VIII puede ser separado por crioprecipitación inicial y ser más purificado por precipitación de agentes o por cromatografía. Los niveles de purificación (fraccionamiento) han sido descritos en términos imprecisos y no oficiales. Un término es "actividad específica", que se define como la cantidad de unidades de factor por mg de proteína. En los concentrados altamente purificados que necesitan la adición de albúmina para su estabilización, la actividad específica final es baja. La "actividad específica descontando la albúmina" es una guía actual para nivel de purificación, sin embargo, con el desarrollo del Factor VIII altamente purificado reteniendo el FvW, una mejor guía podría ser "actividad específica descontando la albúmina y el FvW".
Los concentrados de Factor VIII recombinante también contienen albúmina y los niveles de purificación son altos si la albúmina es ignorada. El FvW no está presente en los concentrados de Factor VIII purificados por inmunoafinidad ni en los concentrados recombinantes.
Los concentrados derivados del plasma se elaboran de plasma obtenido de donantes de todos los grupos sanguíneos. Las isoaglutininas para antígenos eritrocitarios A y B están presentes en los concentrados de "pureza intermedia", es decir, aquellos con actividades específicas bajo 10. El t½ de esos anticuerpos es largo, así que se acumulan durante el transcurso prolongado de un tratamiento intensivo (por ejemplo una cirugía) y pueden causar hemólisis en receptores cuyos grupos sanguíneos son A, B o AB. Algunos receptores son mucho más sensibles a la hemólisis que otros. Los niveles de isoaglutininas son muy bajos en concentrados altamente purificados.
Los concentrados son el pilar de la terapia para la hemofilia A severa. Las reacciones alérgicas son raras y el material es estable a temperatura ambiente por lo que son ideales para programas de autoinfusión en el hogar. El concentrado reconstituido es estable por 12 horas o más y puede ser usado para infusión continua.
Entonces, los concentrados de Factor VIII disponibles comercialmente, los podemos clasificar según su origen en:
a) Concentrados Plasmáticos de Factores Humanos: se obtienen a partir de la mezcla de grandes cantidades de plasma. Se distinguen dos fases: una fase de fraccionamiento que tiene por objeto lograr un producto lo más puro posible y una fase de inactivación vírica que tiene por objeto evitar la posible transmisión de virus a través de la administración de estos concentrados. La pureza del factor viene dada por la "actividad específica". Dentro de este grupo están los concentrados monoclonales.
b) Concentrados de Factor VIII Porcino: son útiles para el tratamiento de las hemorragias en los pacientes que han desarrollado inhibidores frente al Factor VIII o al Factor IX. Son de escasa utilidad debido a que producen reacciones alérgicas, algunas de ellas muy graves.
c) Concentrados recombinantes: se obtienen gracias a la clonación molecular del Factor VIII. Teóricamente son los productos más seguros que existen en el mercado debido a que no proceden del plasma humano.
9. Pureza y Seguridad
La "pureza" se refiere a la concentración de un ingrediente deseado en una sustancia. El esfuerzo específico para eliminar una infección viral es el intento de mejorar la "seguridad" de un producto, no la pureza. En la práctica, la seguridad debe tener una prioridad alta en el esfuerzo de lograr la pureza de los hemoderivados. Por ejemplo, un producto de Factor VIII de alta pureza no sirve de nada si está infectado con VIH. Las buenas prácticas de fabricación pueden garantizar la seguridad al mismo tiempo que mejoran la pureza.
Debido a la inestabilidad del Factor VIII aislado, se deben añadir estabilizadores a los concentrados. Estos mismos estabilizadores reducen la pureza de los productos.
Niveles de purificación en la fabricación
10. Seguridad de la Materia Prima
Los procedimientos de selección de donantes que excluyen a donantes de grupos de alto riesgo, en combinación con las pruebas serológicas de las donaciones de plasma, son las medidas más importantes a la hora de garantizar una materia prima segura para el proceso de fraccionamiento.
Existen dos tipos de procesos de reducción vírica: la inactivación (muerte del virus) y la eliminación del virus mediante la purificación proteica. Los procedimientos de eliminación vírica durante el proceso de fabricación son los que han causado el mayor impacto en la mejora de la seguridad de los productos para el tratamiento de la hemofilia.
La inclusión en el proceso de fraccionamiento de uno o varios métodos validados para inactivar y/o eliminar determinados virus, principalmente los virus envueltos (VIH, VHB y VHC) se traduce en unos derivados del plasma que, en esencia, no presentan el riesgo de portar estos virus. Sin embargo, los procesos actuales de inactivación y eliminación son menos eficaces contra virus no envueltos (VHA y Parvovirus B19, aunque este problema también puede abarcar virus y agentes infecciosos aún no descritos).
11. Inactivación Viral
Existen una variedad de métodos de reducción vírica disponibles como solvente-detergente, el tratamiento térmico (pasteurización, calor seco, calor por vapor) y la nanofiltración. Las ventajas y limitaciones de estos métodos se detallan en la tabla 5.
Solvente-Detergente
Tratamiento por calor
Vapor o pasteurización
Tratamiento de calor seco
Supresión Viral
Nanofiltración
Cromatografía por inmunoafinidad: separación con anticuerpos monoclonales (sirve tanto para mejorar la pureza del FVIII como para la seguridad viral).
Debido a la importancia de la eliminación vírica para la máxima seguridad de los derivados del plasma, no se pueden admitir fallos en los pasos del proceso. La validación de los procesos y los sistemas que siguen las normas de correcta fabricación más exigentes, son los elementos básicos para la fabricación fiable de derivados del plasma, seguros y eficaces.
Para los virus no envueltos conocidos, muchos fabricantes han creado programas que suponen unas pruebas límite del lote de plasma con la técnica NAT que apuntan a un nivel máximo de contaminación vírica, en vez de la eliminación absoluta. A falta de métodos de reducción vírica dentro del proceso de fabricación, este sería el mejor método que existe actualmente para reducir la carga vírica del pool de plasma y por lo tanto, para reducir las posibilidades de transmisión de los virus sometidos a pruebas siguiendo esta metodología.
a) Ventajas y limitaciones de los métodos de inactivación y eliminación viral
12. Métodos de Inactivación Viral a Nivel Industrial
a) Solvente Detergente
El tratamiento con solvente-detergente (S/D) es el método más fiable para la reducción de virus envueltos altamente infecciosos y se debe considerar definitivamente como opción preferente en la evaluación de productos. El tratamiento con S/D no es eficaz para la inactivación de virus no envueltos, que también se resisten a otras técnicas de inactivación vírica, por lo que se aconseja adoptar siempre otros métodos dirigidos específicamente a estos virus. Para los concentrados de Factor VIII, se ha demostrado que el calentamiento en solución y en menor medida el tratamiento por calor seco contribuye a la eliminación de virus no envueltos.
b) Nanofiltración
La nanofiltración es una opción para el Factor IX y otras proteínas del plasma de menor tamaño; sin embargo puede que no sea la mejor opción para los concentrados de Factor VIII hasta que no se validen más membranas. Una ventaja adicional de los procedimientos con S/D y la nanofiltración es el bajo riesgo de inducción de neoantígenos proteicos.
c) Métodos Cromatográficos
v. Principio general de cromatografía en columna
La cromatografía es una técnica que se emplea en el fraccionamiento de proteínas. Consiste en la aplicación de una muestra compleja de proteínas a una columna de cristal en la que se ha situado una matriz sólida porosa que está inmersa en el solvente. A continuación se bombea una gran cantidad de solvente a través de la columna. Las diferentes proteínas se van retrasando de manera distinta según sus interacciones con la matriz, por lo que pueden ser recogidas separadas a medida que son eluidas por el fondo de la columna (Fig. A). Según la matriz escogida, las proteínas se pueden separar de acuerdo a su carga, su hidrofobicidad, su tamaño o su capacidad de unirse a grupos químicos particulares, peso molecular, carga eléctrica, afinidad de una de ellas por alguna otra, etc. En función de cual sea el criterio de separación que se aplique, diferenciamos tres tipos de cromatografía en columna: cromatografía de intercambio iónico (Fig. B), cromatografía de filtración en gel (Fig. C) y cromatografía de afinidad y de inmunoafinidad (Fig. D).
vi. Cromatografía de intercambio iónico:
Se realiza sobre matrices de columna (sustancia que está empapada de solvente y que se empaqueta en la columna. También se denomina lecho de la columna) que tienen una carga neta, positiva o negativa. La carga de la matriz de la columna así como la carga de las proteínas dependerá del pH del solvente y de su fuerza iónica (proporcional a la concentración de iones). En unas condiciones determinadas serán retenidas en la columna, las proteínas que tengan una carga complementaria a la de la matriz del gel (las proteínas cargadas negativamente serán retenidas por una matriz cargada positivamente), siendo eluidas las restantes. Para eluir las proteínas retenidas se puede variar la carga iónica del solvente o su pH de forma que se alcance el punto isoeléctrico de la proteína de interés o el de la matriz, neutralizando de este modo la fuerza que retiene a las proteínas en la columna.
Este método de purificación del Factor VIII, produce un Factor VIII que posee una alta actividad específica, aproximadamente 100 UI/mg de proteína total, en la cual el FvW se mantiene unido como estabilizador natural del Factor VIII, luego se realiza una precipitación salina que permite la eliminación de Fibronectina y restos de Fibrinógeno, consiguiendo un Factor VIII y FvW altamente purificado. No se añade albúmina como estabilizante.
vii. Cromatografía de filtración en gel:
Este método ya lo mencionamos durante la elaboración del factor VIII con el método S/D.
Esta cromatografía se realiza empleando unas matrices formadas por unas esferas porosas. El volumen de los poros es muy elevado y su diámetro está determinado. Cuando penetran en el lecho de la columna dos proteínas de tamaños tales que una penetra en los poros de las bolas de gel y la otra no, la primera se reparte entre el espacio entre las bolas y el interior de los poros, reduciéndose la concentración en la fase libre entre las bolas. La segunda proteína, por su tamaño, sólo puede encontrarse entre las bolas. El flujo del solvente es más elevado entre las bolas que en el interior de los poros de éstas, por lo que el efecto neto es el de acelerar el desplazamiento de las proteínas de mayor peso molecular respecto al de las de menor peso molecular. En esta cromatografía se eluyen primero las proteínas mayores, y en segundo lugar las menores, y tiene una gran influencia en el resultado, la longitud de la columna y el volumen de la misma. Columnas largas aseguran separaciones de mayor calidad.
viii. Cromatografía de afinidad y de inmunoafinidad:
En esta cromatografía las bolas de gel que conforman el lecho de la columna presentan, unido en su superficie, un ligando, una molécula ante la que tiene afinidad una o más de las proteínas presentes en la mezcla a separar. Al atravesar la columna, el ligando secuestra sobre la superficie de las bolas de gel, la proteína afín y deja pasar el resto. La elución de la proteína afín se puede conseguir modificando las propiedades de carga del ligando variando el pH hasta alcanzar su punto isoeléctrico, variando la fuerza iónica del solvente, etc., con lo que se reduce la intensidad de la interacción hasta anularla.
La naturaleza del ligando es muy variada (heparina, agarosa), puede ser un receptor (proteína) unido a las bolas, que seleccionará su/s ligando/s de una mezcla compleja, o el antígeno empleado en una inmunización el que recubre las bolas y que retendrá del suero o plasma aquellos anticuerpos que lo reconocen (anticuerpos purificados por afinidad), o en el caso de la inmunoafinidad, el ligando que recubre las bolas son anticuerpos que retienen en la columna, a aquellas proteínas que contienen los epítopes que reconocen (origen monoclonal)
En ocasiones, la cromatografía de afinidad se realiza incubando el gel recubierto con el ligando directamente con la solución que contiene las proteínas a purificar. Posteriormente se empaqueta la columna y se procede a la elución, primero de las proteínas no unidas y posteriormente de las retenidas.
d) Purificación por anticuerpos monoclonales
Luego de ser separado el Factor VIII de las otras proteínas por el anticuerpo monoclonal, es posteriormente sometido a un proceso de cromatografía de intercambio iónico para reducir otros contaminantes que pudieran haber quedado en el eluído final, como por ejemplo algunos virus no envueltos como VHA y Parvovirus. Hoy día, todos los productos comerciales de Factor VIII monoclonal son sometidos a cromatografía de intercambio iónico que además de servir para purificar el Factor VIII durante el fraccionamiento, sirve de método adicional de eliminación viral.
e) Tecnología Recombinante
Se basa en recombinar el ADN nativo usando líneas celulares animales para producir grandes cantidades de Factor VIII recombinante de alta pureza. Usando esta tecnología se puede sintetizar en el laboratorio la proteína pura que se desee una vez que es extraída de la sangre. El Factor VIII recombinante está libre de virus que pueden estar presentes en el plasma además de estar libre de otras proteínas plasmáticas responsables de efectos inmunosupresores y reacciones alérgicas.
La recombinación genética, léase la combinación de segmentos de ADN de diferente origen, es un fenómeno universal que ocurre en todos los organismos, desde el más elemental hasta el más complejo, dando así las diferencias entre los individuos.
Esta tecnología nos permite obtener fragmentos de ADN en cantidades ilimitadas, que llevará además el gen o los genes que se desee. Este ADN puede incorporarse a las células de otros organismos (vegetales, animales, bacterias) en los que se podrá expresar la información de dichos genes.
Primero se "corta" el fragmento específico del ADN donde está el gen que codifica la proteína de Factor VIII, a través de la enzima de restricción específica para una secuencia de nucleótidos.
Los fragmentos obtenidos se pueden separar por tamaños según el número de nucleótidos que lleven. Según donde se hallen las secuencias de reconocimiento, un gen determinado puede estar fragmentado en varios trozos.
Una vez reconocidos los fragmentos del gen que deseo recombinar, lo inserto en "vectores", que son agentes transportadores capaces de introducirlos en las células hospedadoras. Los "vectores" de clonación son pequeñas moléculas de ADN que tienen capacidad para autorreplicarse dentro de las células hospedadoras. Se utilizan con frecuencia dos tipos de vectores de clonación: plásmidos y virus.
Los plásmidos son moléculas de ADN circular con un tamaño menor que el del cromosoma. Se replican con independencia del cromosoma bacteriano ya que tienen su propio origen de replicación.
La unión del ADN que contiene el gen que se desea clonar con el vector de clonación, se realiza por medio de otras enzimas denominadas ADN-ligasas, que unen ambos trozos de ADN. El resultado es una molécula de ADN recombinante, ya que contiene fragmentos de ADN de distinta procedencia.
El siguiente paso será introducir el vector de clonación que contiene el gen que se quiere clonar en la célula hospedadora, para que ésta al multiplicarse, origine un clon celular que lleve el gen concreto.
13. Purificación, Inactivación Viral y Preparación del Factor VIII
Este método de producción es utilizado en Quimbiotec para la elaboración de Factor VIII
14. Seguridad Viral
El Factor VIII se extrae del crioprecipitado mediante una serie de etapas selectivas de precipitación, centrifugación y filtración, durante las cuales se logra cierto grado de disminución viral. Luego se siguen dos procedimientos específicos e independientes de inactivación viral, para disminuir el riesgo de infección por parte de virus con y sin envoltura.
Para cuantificar la disminución viral durante la fabricación, se investigaron cuatro etapas del proceso de producción del Factor VIII:
a) Eliminación del crioprecipitado del depósito de plasma descongelado (crioeliminación).
b) Adsorción mediante hidróxido de aluminio y precipitación con polietilenglicol del crioprecipitado disuelto en agua (adsorción+precipitación).
c) Tratamiento del Factor VIII soluble con TNBP y polisorbato 80 (tratamiento S/D)
d) Tratamiento térmico a 100°C (este valor es variable de una compañía a otra) del Factor VIII congelado en seco durante 30 minutos.
Para estos estudios se eligieron (según las recomendaciones de la Agencia Europea para la Evaluación de Medicamentos, Comité de Especialidades Farmacéuticas/Grupo de Trabajo de Biotecnología) los siguientes virus:
VIH-1 y otros modelos virales que representan familias de virus con diferente estructura física, composición bioquímica y sensibilidad al calor y a las sustancias químicas
El Virus de la Diarrea Viral Bovina (BVDV), un virus ARN con envoltura, fue seleccionado como modelo para la hepatitis C.
El Virus de la Seudorrabia (PRV), un virus de ADN fue seleccionado como modelo para los virus herpes (HSV) clínicamente relevantes: Citomegalovirus (CMV), virus de Epstein-Barr y virus de herpes Simple tipos 1, 2, 6 y 7.
El Virus de la Estomatitis Vesicular (VSV), un virus ARN con envoltura fue incluido debido a que demostró resistencia a la inactivación con el tratamiento S/D.
El Reovirus, un virus de ARN, fue elegido como modelo de los virus sin envoltura.
El virus de la Hepatitis A (HAV) y el Parvovirus porcino (PPV), elegido para representar al Parvovirus humano B19, se utilizaron para investigar la eficacia del proceso térmico a 80°C. En la tabla 6 se encuentra la lista de los modelos virales y sus características.
Se examinó la eliminación del virus de la Diarrea Viral Bovina y del virus de la Seudorrabia en las cuatro etapas. Los experimentos realizados con dichos virus mostraron que la disminución viral se produce principalmente en las etapas solvente/detergente y térmica a 80 °C. En consecuencia, la eliminación del virus de la Estomatitis Vesicular y del VIH-1 sólo se evaluó en las etapas 3 y 4. Puesto que el tratamiento S/D no es eficaz para la inactivación de los virus sin envoltura, la eliminación del Reovirus sólo se evaluó en las etapas 1, 2 y 4. En la tabla 6 se encuentra la lista de los modelos virales y sus características.
Por convención, la disminución de la actividad viral (o título viral) se mide en una escala logarítmica, expresada en unidades de log¹º. Cada disminución de un log¹º da como resultado un título viral diez veces menor. Por ejemplo:
| Disminución de la Actividad Viral |
|
| Factor de Disminución | Virus Restantes |
| log(10) | % |
| 0 | 100,0 |
| 1 | 10,0 |
| 2 | 1,0 |
| 4 | 0,01 |
| 6 | 0,001 |
Si un proceso lleva varias etapas de preparación y purificación, el factor de reducción global puede calcularse sumando factores de disminución de las etapas individuales, expresados en log¹º. Sin embargo, sólo deben agregarse las etapas en las que se empleen mecanismos diferentes de eliminación o inactivación viral. Las etapas que suministran una disminución menor que un log¹º no se incluyen en el cálculo de reducción global.
En la actualidad, la industria del plasma sigue dos pautas recomendadas para la reducción viral. El Grupo de Trabajo Ad Hoc de Biotecnología/Farmacia de la Unión Europea, publicó las pautas "Blood Products and Non-Enveloped Viruses" (III/5830/93), en las que recomienda que la fabricación de productos derivados de la sangre incluya una etapa en la que se eliminen al menos 4 log¹º de la actividad de los virus sin envoltura.
El Instituto Paul Ehrlich, organismo alemán de otorgamiento de licencias, por su parte aconseja que los procesos de producción incluyan dos etapas, cada una capaz de eliminar al menos 4 log¹º de la actividad de los virus con envoltura.
La reducción de cada uno de los virus de prueba que se alcanza en cada etapa relevante de la fabricación del producto se muestra en la tabla 7.
La mayor disminución de la carga viral se logró en las dos etapas de inactivación, etapas 3 y 4, en dada una de las cuales se obtuvo la disminución de al menos 4 log¹º de cada uno de los modelos virales.
Al estudiar la eficacia y reproducibilidad del proceso térmico a 80°C al que son sometidos los viales finales, congelados en seco, los científicos han determinado que el contenido de humedad en el vial es importante para lograr la reducción viral adecuada.
No hay que olvidar que la seguridad viral comienza con la minuciosa selección de los donantes, el examen del plasma y los períodos de espera y cuarentena para reducir al mínimo, el riesgo de que los agentes infecciosos entren en el depósito de plasma antes del fraccionamiento y fabricación del producto.
Los Factores VIII concentrados se están distribuyendo ampliamente por el mundo a través de ventas y donaciones formales. Tanto los compradores de productos importados como los receptores de productos donados han solicitado a las entidades internacionales la caracterización de estos concentrados.
En 1.977, para ayudar a la identificación de varias marcas, el Subcomité de Factor VIII y IX (Comité Científico de Normalización, Sociedad Internacional de Trombosis y Hemostasis) comenzó un registro de los factores de concentrados de coagulación producidos para el tratamiento de las deficiencias congénitas de la coagulación. Este documento fue distribuido por la Federación Mundial de la Hemofilia, primero en forma impresa y luego en Internet (www.wfh.org). Este registro se actualiza cada uno o dos años con el fin de incluir información sobre concentrados nuevos y modificaciones en los concentrados existentes, así como cambios en los nombres de las compañías farmacéuticas o funciones de las mismas.
15. Características Finales de cada Factor VIII Comercial
Por regulaciones de las autoridades sanitarias de cada país productor y/o consumidor de concentrados de factores de coagulación, los fabricantes de hemoderivados deben someter a varias pruebas el producto final para comprobar que se ajusta a una especificación predeterminada. Esto es fundamental como parte del control de calidad del producto para su comercialización. Las características físico-químicas en el producto final deben estar dentro de ciertos rangos establecidos como inocuos para el humano.
Estas pruebas que se realizan en los productos antes de su salida oficial al mercado se llaman "pruebas de liberación de lote". La calidad del producto depende de que los métodos de prueba y los criterios de salida al mercado hayan sido aprobados como parte del proceso global de revisión y que cumplan todas las normas de correcta fabricación. Hay que destacar que el proceso global es lo que aporta calidad y seguridad al producto.
Si las autoridades nacionales creen que las pruebas de producto final aportan un cierto nivel de garantía de calidad y seguridad, deben adaptar las medidas adoptadas por agencias reguladoras acreditadas o del protocolo de liberación de lotes del Departamento Europeo para la Calidad de los Medicamentos.
Se debe tener en cuenta que las pruebas de producto final no se pueden usar para garantizar la seguridad vírica. Las pruebas empleadas para la detección de agentes víricos en el plasma, tanto si se realizan en donaciones como en lotes y tanto si son serológicas como moleculares, no han sido diseñadas ni validadas para probar productos finales. El empleo de estas pruebas en productos finales está totalmente fuera de lugar y no aporta nada a la garantía de seguridad de los productos. Su aplicación puede llevar a la evaluación incorrecta de la calidad y seguridad de un producto y demorar su salida al mercado.
16. Parámetros para los Análisis del Factor VIII Recomendados Por los Entes Reguladores a Nivel Mundial
Los criterios exigidos por el ente regulatorio INHRR Instituto Nacional de Higiene Rafael Rangel para liberar un lote de Factor VIII en Venezuela son todos los expuestos anteriormente.
Todas las presentaciones comerciales de concentrados de FVIII vienen liofilizadas, para mayor estabilidad de la proteína, contenida en un vial de vidrio a una determinada concentración: 250, 500 o 1.000 UI por vial, acompañado de un vial con agua estéril como diluyente cuyo volumen puede ser de 5 ml o 10 ml.
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